造一个 furin 位点根本不难，难的是承认它不罕见
深度测序显示，冠状病毒基因组里每千个就有几个带插入，furin 位点在同一位置至少被独立撞上三次——实验室起源论的概率论证站不住脚。
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改掉 GFP 序列，重组率反而涨了
团队先搭 OC43 反向遗传系统，做出一对病毒：各自带一个被移码突变的 GFP，单独感染只产碎片，共感染后一旦重组就能拼出绿色荧光蛋白。他们本以为把其中一个 GFP 的核苷酸序列改掉，重组率会下降，结果反而上升。Paul 说这只有假说没有数据，一个可能是双链 RNA 形成后，重组时的链转移事件会因双链「呼吸」而更容易发生。这个反直觉结果后来成了整篇论文的试剂起点。
— Paul Bieniasz把 GFP 敲出读框，让插入自己现形
测插入缺失比测点突变难得多，因为过去认为它们罕见，测序深度也不够。他们的做法是把 GFP 基因放进病毒基因组再故意敲出读框，前面接一个与 GFP 不同框的起始密码子肽段，病毒不发绿；只有当这个位点获得特定长度的插入或缺失、把 GFP 重新拉回读框时才会变绿。这样既能数事件频率，又能挑出绿色病毒回读序列、反推机制。这就是论文 figure 1 的由来。
— Paul Bieniasz敲掉 NSP15 反而让插入变少
原本的假设来自前人工作，认为 NSP15 这个核酸酶会影响缺失率——想到核酸酶，人自然想到缺失，不会想到插入。但实验里出现的是相反方向：带 NSP15 的病毒获得插入、把 GFP 拉回读框的速率大幅提高。Paul 说缺失率这次数字不够没法定量，但插入这一项是黑白分明的结果，他们当时非常意外，正是这个偶然结果开启了整条研究线。
— Paul Bieniasz每个碱基被测一百万次，才敢谈频率
从挑绿色病毒转向直接暴力测序：把约 10 毫升病毒浓缩到 1 毫升，取一部分上测序芯片，产出数亿条 reads，使基因组上每个核苷酸至少被测一百万次，每个病毒库的数据量约等于 30 个人类基因组或 300 万个病毒基因组。Paul 强调深度要和样本里的病毒粒子数匹配——管里只有一千个病毒粒子却测几亿次毫无意义，他们校准到大约测到样本中百分之几的病毒。
— Paul Bieniasz11 个核苷酸是判断来源的门槛
短插入（三到六个核苷酸）在病毒基因组里靠随机就能出现，无法确定来源，所以分析时被排除。他们算出：一段 11 个核苷酸若能完美匹配病毒基因组，纯属偶然的概率低于 5%，于是把分析限定在 11 个核苷酸以上的插入。结果 90% 以上能完美或近乎完美匹配病毒基因组，且在 OC43 里野生型病毒的插入比 NSP15 突变体多 87 倍，多数来自正链。
— Paul Bieniasz插入不是罕见事件，是每千个几个
Vincent 说多年来被告知插入很罕见，但数据显示这似乎一直在发生。Paul 回应「罕见」是相对词：百万分之一叫罕见，但如果你有一千万个，它就是常见。他们给出的插入频率是每千个基因组有几个——一千个病毒粒子里大约五到十个基因组带插入。这个频率比点突变低，但没有低太多。之所以过去觉得罕见，是因为绝大多数插入对病毒有害甚至致死，在低感染复数下会被清除，所以分离不到。
— Paul Bieniasz造一个 furin 位点根本不难
机制上，furin cleavage site 最低只需要两个精氨酸 RXXR，甚至只有一个精氨酸、其他氨基酸配合也能被切割。64 个密码子里 6 个编码精氨酸，两个分数相乘，约 1% 的随机 12 碱基序列就能编码 RXR motif。冠状病毒基因组里大约有 30,000 个不同位置可以发生插入突变。所以这不是什么巨大的工程挑战。
— Paul Bieniasz闪电至少劈中同一个地方三次
把插入发生的频率、可插入位点数量、病毒种群规模放在一起算，furin cleavage site 出现在冠状病毒基因组某个特定位置的概率并不惊人，而且与深度测序的实测结果大致吻合。在他们未覆盖全种群的深度测序数据里，已经在 SARS-CoV-2 现有 furin 位点所在的那个精确位置，至少三次独立发现了新的 furin cleavage site。Paul 说论文里的数字是低估：他们只聚焦 spike 那一段做 PCR，还要求插入与病毒基因组完美匹配以排除 PCR 假象，这很可能也排除了部分真实存在的天然位点。
— Paul Bieniasz每个主导变异株都始于一个 RNA 分子
Delta、Omicron 等每一个主导变异株，世界上几乎每一条序列，最初都只是某个人肺部某个时间点的一个 RNA 分子。单个事件再不可能，也足以引发一次全球传播。所以基于「某事发生概率极低」的论证站不住脚——生物学里发生的每件事都极其罕见。Paul 同时指出，furin cleavage site 并非总是对 SARS-CoV-2 有利，许多细胞培养实验里病毒被选择丢失这个位点，spike 三聚体的稳定性与融合性之间很可能是一种刀刃上的平衡。
— Paul Bieniasz小鼠基因序列拼出了 SARS ass
Harrison 和 Saxs 在 PNAS 的论文主张 SARS-CoV-2 的实验室起源，把 UNC 研究过的上皮钠转运蛋白的 furin cleavage site 列为可能的插入候选。但那个小鼠上皮钠转运蛋白 furin 位点的氨基酸序列，拼出来正好是「SARS ass」。Paul 说他们轻描淡写地带过了这个候选序列有一半已经存在于其他 sarbecovirus 中。
— Paul Bieniasz原话 · 已逐字校验
So um when you think nucleas you think deletion you don't really think insertion. Um but in fact the opposite occurred
所以，当你想到核酸酶，你想到的是缺失，你不会真的想到插入。但事实上发生的是相反的情况。
Paul Bieniasz13:15
The sort of the cutoff where you begin to get confident about the origin of your inserts is around 11 nucleotides.
你开始对插入来源有信心的那个门槛，大约在 11 个核苷酸。
Paul Bieniasz27:32
you know one in a one in a million is rare. But if you have 10 million, it's common.
你知道，百万分之一是罕见。但如果你有一千万个，它就是常见。
Paul Bieniasz36:41
it's been a um kind of a an argument that's largely been dominated by people just insulting each other.
这场争论在很大程度上一直是被互相侮辱的人主导的。
Paul Bieniasz52:01
arguments based on the probability of something happening being extremely remote just don't really hold any water because the there's every everything that happens in biology is extremely rare.
基于某事发生概率极低这一点所做的论证根本站不住脚，因为生物学里发生的每一件事都极其罕见。
Paul Bieniasz1:08:23
And if you look at the amino acid sequence of that furine cleavage site, it spells out something very interesting. Spells out SARS ass.
如果你去看那个 furin 位点的氨基酸序列，它拼出了很有意思的东西。拼出来是 SARS ass。
Paul Bieniasz1:11:24
People, I guess, think if you're screaming that you have more of an impact, but doesn't work that way.
我猜人们以为，如果你在尖叫，你就有更大的影响力，但事情不是那样运作的。
Vincent Racaniello1:42:47
数字与实体
| 每个病毒库测序数据量 | 约等于 30 个人类基因组或 300 万个病毒基因组 | 22:26 |
| OC43 野生型与 NSP15 突变体的插入丰度比 | 87 倍 | 27:32 |
| 随机 12 碱基序列编码 RXR motif 的比例 | 约 1% | 55:05 |
| 冠状病毒基因组中可发生插入突变的位置数 | 约 30,000 | 55:05 |
| PCR 等分所用的 RNA 分子数 | 10^8 或 10^9 | 59:09 |
| 亚马逊货机隐形眼镜载重 | 32,000 磅 | 1:41:47 |
术语
- furin cleavage site弗林蛋白酶切割位点
- 冠状病毒 spike 蛋白上一段被宿主 furin 酶切开的短序列，影响膜融合效率。
- NSP15非结构蛋白 15
- 冠状病毒编码的一种核酸酶，本被认为与缺失突变相关。
- RXXR精氨酸-任意-任意-精氨酸基序
- furin 识别的最短氨基酸模式，两个精氨酸是关键。
- sarbecovirus沙贝病毒亚属
- 冠状病毒的一个亚属，SARS-CoV 与 SARS-CoV-2 都属其中。
- OC43人冠状病毒 OC43
- 引起普通感冒的常见冠状病毒，本集用它做反向遗传实验。
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对病毒进化、实验室起源争论、深度测序方法学感兴趣的读者；想看到用定量数据而非口水拆解争议的人。
结尾 1:41 之后聊假橄榄油和隐形眼镜的闲谈，与科学内容无关。