造一個 furin 位點根本不難，難的是承認它不罕見
深度測序顯示，冠狀病毒基因組裡每千個就有幾個帶插入，furin 位點在同一位置至少被獨立撞上三次——實驗室起源論的概率論證站不住腳。
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核心論點 · 點時間戳可跳到原聲
改掉 GFP 序列，重組率反而漲了
團隊先搭 OC43 反向遺傳系統，做出一對病毒：各自帶一個被移碼突變的 GFP，單獨感染只產碎片，共感染後一旦重組就能拼出綠色熒光蛋白。他們本以為把其中一個 GFP 的核苷酸序列改掉，重組率會下降，結果反而上升。Paul 說這只有假說沒有數據，一個可能是雙鏈 RNA 形成後，重組時的鏈轉移事件會因雙鏈「呼吸」而更容易發生。這個反直覺結果後來成了整篇論文的試劑起點。
— Paul Bieniasz把 GFP 敲出讀框，讓插入自己現形
測插入缺失比測點突變難得多，因為過去認為它們罕見，測序深度也不夠。他們的做法是把 GFP 基因放進病毒基因組再故意敲出讀框，前面接一個與 GFP 不同框的起始密碼子肽段，病毒不發綠；只有當這個位點獲得特定長度的插入或缺失、把 GFP 重新拉回讀框時才會變綠。這樣既能數事件頻率，又能挑出綠色病毒回讀序列、反推機制。這就是論文 figure 1 的由來。
— Paul Bieniasz敲掉 NSP15 反而讓插入變少
原本的假設來自前人工作，認為 NSP15 這個核酸酶會影響缺失率——想到核酸酶，人自然想到缺失，不會想到插入。但實驗裡出現的是相反方向：帶 NSP15 的病毒獲得插入、把 GFP 拉回讀框的速率大幅提高。Paul 說缺失率這次數字不夠沒法定量，但插入這一項是黑白分明的結果，他們當時非常意外，正是這個偶然結果開啟了整條研究線。
— Paul Bieniasz每個鹼基被測一百萬次，才敢談頻率
從挑綠色病毒轉向直接暴力測序：把約 10 毫升病毒濃縮到 1 毫升，取一部分上測序芯片，產出數億條 reads，使基因組上每個核苷酸至少被測一百萬次，每個病毒庫的數據量約等於 30 個人類基因組或 300 萬個病毒基因組。Paul 強調深度要和樣本里的病毒粒子數匹配——管裡只有一千個病毒粒子卻測幾億次毫無意義，他們校準到大約測到樣本中百分之幾的病毒。
— Paul Bieniasz11 個核苷酸是判斷來源的門檻
短插入（三到六個核苷酸）在病毒基因組裡靠隨機就能出現，無法確定來源，所以分析時被排除。他們算出：一段 11 個核苷酸若能完美匹配病毒基因組，純屬偶然的概率低於 5%，於是把分析限定在 11 個核苷酸以上的插入。結果 90% 以上能完美或近乎完美匹配病毒基因組，且在 OC43 裡野生型病毒的插入比 NSP15 突變體多 87 倍，多數來自正鏈。
— Paul Bieniasz插入不是罕見事件，是每千個幾個
Vincent 說多年來被告知插入很罕見，但數據顯示這似乎一直在發生。Paul 回應「罕見」是相對詞：百萬分之一叫罕見，但如果你有一千萬個，它就是常見。他們給出的插入頻率是每千個基因組有幾個——一千個病毒粒子裡大約五到十個基因組帶插入。這個頻率比點突變低，但沒有低太多。之所以過去覺得罕見，是因為絕大多數插入對病毒有害甚至致死，在低感染複數下會被清除，所以分離不到。
— Paul Bieniasz造一個 furin 位點根本不難
機制上，furin cleavage site 最低只需要兩個精氨酸 RXXR，甚至只有一個精氨酸、其他氨基酸配合也能被切割。64 個密碼子裡 6 個編碼精氨酸，兩個分數相乘，約 1% 的隨機 12 鹼基序列就能編碼 RXR motif。冠狀病毒基因組裡大約有 30,000 個不同位置可以發生插入突變。所以這不是什麼巨大的工程挑戰。
— Paul Bieniasz閃電至少劈中同一個地方三次
把插入發生的頻率、可插入位點數量、病毒種群規模放在一起算，furin cleavage site 出現在冠狀病毒基因組某個特定位置的概率並不驚人，而且與深度測序的實測結果大致吻合。在他們未覆蓋全種群的深度測序數據裡，已經在 SARS-CoV-2 現有 furin 位點所在的那個精確位置，至少三次獨立發現了新的 furin cleavage site。Paul 說論文裡的數字是低估：他們只聚焦 spike 那一段做 PCR，還要求插入與病毒基因組完美匹配以排除 PCR 假象，這很可能也排除了部分真實存在的天然位點。
— Paul Bieniasz每個主導變異株都始於一個 RNA 分子
Delta、Omicron 等每一個主導變異株，世界上幾乎每一條序列，最初都只是某個人肺部某個時間點的一個 RNA 分子。單個事件再不可能，也足以引發一次全球傳播。所以基於「某事發生概率極低」的論證站不住腳——生物學裡發生的每件事都極其罕見。Paul 同時指出，furin cleavage site 並非總是對 SARS-CoV-2 有利，許多細胞培養實驗裡病毒被選擇丟失這個位點，spike 三聚體的穩定性與融合性之間很可能是一種刀刃上的平衡。
— Paul Bieniasz小鼠基因序列拼出了 SARS ass
Harrison 和 Saxs 在 PNAS 的論文主張 SARS-CoV-2 的實驗室起源，把 UNC 研究過的上皮鈉轉運蛋白的 furin cleavage site 列為可能的插入候選。但那個小鼠上皮鈉轉運蛋白 furin 位點的氨基酸序列，拼出來正好是「SARS ass」。Paul 說他們輕描淡寫地帶過了這個候選序列有一半已經存在於其他 sarbecovirus 中。
— Paul Bieniasz原話 · 已逐字校驗
So um when you think nucleas you think deletion you don't really think insertion. Um but in fact the opposite occurred
所以，當你想到核酸酶，你想到的是缺失，你不會真的想到插入。但事實上發生的是相反的情況。
Paul Bieniasz13:15
The sort of the cutoff where you begin to get confident about the origin of your inserts is around 11 nucleotides.
你開始對插入來源有信心的那個門檻，大約在 11 個核苷酸。
Paul Bieniasz27:32
you know one in a one in a million is rare. But if you have 10 million, it's common.
你知道，百萬分之一是罕見。但如果你有一千萬個，它就是常見。
Paul Bieniasz36:41
it's been a um kind of a an argument that's largely been dominated by people just insulting each other.
這場爭論在很大程度上一直是被互相侮辱的人主導的。
Paul Bieniasz52:01
arguments based on the probability of something happening being extremely remote just don't really hold any water because the there's every everything that happens in biology is extremely rare.
基於某事發生概率極低這一點所做的論證根本站不住腳，因為生物學裡發生的每一件事都極其罕見。
Paul Bieniasz1:08:23
And if you look at the amino acid sequence of that furine cleavage site, it spells out something very interesting. Spells out SARS ass.
如果你去看那個 furin 位點的氨基酸序列，它拼出了很有意思的東西。拼出來是 SARS ass。
Paul Bieniasz1:11:24
People, I guess, think if you're screaming that you have more of an impact, but doesn't work that way.
我猜人們以為，如果你在尖叫，你就有更大的影響力，但事情不是那樣運作的。
Vincent Racaniello1:42:47
數字與實體
| 每個病毒庫測序數據量 | 約等於 30 個人類基因組或 300 萬個病毒基因組 | 22:26 |
| OC43 野生型與 NSP15 突變體的插入丰度比 | 87 倍 | 27:32 |
| 隨機 12 鹼基序列編碼 RXR motif 的比例 | 約 1% | 55:05 |
| 冠狀病毒基因組中可發生插入突變的位置數 | 約 30,000 | 55:05 |
| PCR 等分所用的 RNA 分子數 | 10^8 或 10^9 | 59:09 |
| 亞馬遜貨機隱形眼鏡載重 | 32,000 磅 | 1:41:47 |
術語
- furin cleavage site弗林蛋白酶切割位點
- 冠狀病毒 spike 蛋白上一段被宿主 furin 酶切開的短序列，影響膜融合效率。
- NSP15非結構蛋白 15
- 冠狀病毒編碼的一種核酸酶，本被認為與缺失突變相關。
- RXXR精氨酸-任意-任意-精氨酸基序
- furin 識別的最短氨基酸模式，兩個精氨酸是關鍵。
- sarbecovirus沙貝病毒亞屬
- 冠狀病毒的一個亞屬，SARS-CoV 與 SARS-CoV-2 都屬其中。
- OC43人冠狀病毒 OC43
- 引起普通感冒的常見冠狀病毒，本集用它做反向遺傳實驗。
收聽指南
對病毒進化、實驗室起源爭論、深度測序方法學感興趣的讀者；想看到用定量數據而非口水拆解爭議的人。
結尾 1:41 之後聊假橄欖油和隱形眼鏡的閒談，與科學內容無關。