不剪一刀DNA,新療法讓98%乙肝肝細胞停止產生病毒蛋白
現有乙肝藥只能壓制病毒複製、清不掉佔據細胞核的病毒DNA;新療法用改造過的dCas9給病毒DNA打上永久甲基化標籤，讓它在肝細胞裡徹底沉默。
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死胎率是背景值數倍
11只孕晚期豚尾猴被經鼻、氣管、眼、口同時接種高劑量甲流病毒以確保感染，但仍有4只全程沒有症狀，另有2只病情最重，其中一隻(編號Blue Nine)發生死胎。這家機構6年數據顯示正常妊娠死胎率是2.6%,這次11只裡出了2只死胎(孕134天和121天，約為足月172天的七成多)。母猴體內病毒自始至終侷限在肺部，血漿檢測不到病毒RNA。
— Kathy病毒沒過胎盤，胎盤自己報警
只有2例在胎盤絨毛組織里檢出低拷貝病毒RNA,胎兒的腦、脊髓、心、肝、脾等組織全部陰性——沒有垂直傳播，胎盤擋住了病毒。但胎盤絨毛組織里IL-1β、IL-18、干擾素β等細胞因子明顯升高，185個基因上調、178個下調，說明胎盤自己啟動了抗病毒反應。沒人知道是什麼信號穿過了胎盤讓它做出反應，研究者也坦言這是留給下一步研究的問題。
母親越重，胎兒免疫越亂
母猴肺部病情越重、1型干擾素水平越高，胎兒血液和肺裡的CD8 T細胞、樹突狀細胞等免疫群體變化就越大，即便病毒從未進入胎兒體內。研究者特別強調，這個結果不該被讀成「孕期免疫反應本身很危險」,反而說明打疫苗、避免孕婦發展成重症，才是減少胎兒免疫紊亂最直接的辦法。
— Brianna乙肝藥壓病毒，壓不掉DNA
全球2.5億人感染乙肝，每年約百萬人死於肝硬化和肝癌，卻幾乎沒有媒體關注——只有反疫苗聲音出現時才會被提起。現有一線藥物「nukes」能抑制病毒複製、降低硬化和癌變風險，但清不掉細胞核裡的共價閉合環狀DNA(cccDNA)和整合進宿主基因組的病毒DNA,也壓不住表面抗原的產生，患者往往要像HIV感染者一樣終身服藥。
不剪DNA,給病毒打沉默標籤
新療法Crema 1001的核心是一個完全人造的融合蛋白：催化失活的Cas9(只結合DNA不切割)+抑制轉錄的KRAB結構域+甲基化效應結構域，由guide RNA引導精準停靠到乙肝基因組上。研究者從121條候選guide RNA裡篩出51條能讓抗原下降超過50%,最終選定對各基因型兼容性最好的gRNA2。整套機制借用CRISPR的定位能力，卻完全不使用它的切割功能。
— Kathy單次注射，98%肝細胞轉陰
在整合了兩套乙肝全基因組的轉基因小鼠模型裡，單次給藥讓表面抗原最多下降2.7個log、病毒DNA下降2.9個log,效果維持滿7個月觀察期；15只小鼠裡11只抗原降到檢測限以下，最高劑量組98%的肝細胞核心抗原染色呈陰性——但整合的病毒DNA仍然原樣留在細胞裡，只是被永久沉默，沒有被切除。
— Kathy藥7天排空，沉默卻留下了
注射的guide RNA、效應蛋白mRNA在24小時內達到峰值，但7天后體內已經檢測不到任何殘留；而病毒DNA上的甲基化標記在給藥後第3天達到頂峰，並一直持續到實驗觀察期結束。此前同類研究顯示這種甲基化標記能在小鼠和非人靈長類體內維持超過一年——藥物本身很快被清除，但留下的沉默開關會隨細胞分裂一起傳下去。
— Rich1591個疑點，只剩4個
用最多允許4個錯配的條件做計算機預測，在肝細胞、脾內皮細胞、腎上腺皮質細胞裡一共找到1591個guide RNA可能誤傷的位置；逐一驗證後，只有4處真的出現異常甲基化，而且全部沒有對應的基因表達改變，因此研究者認定沒有「已驗證的意外靶點」。作者也承認每種細胞只測了一個供體、沒檢測生殖細胞，監管層面還會有更多要求。
— Kathy原話 · 已逐字校驗
The placenta knows there's an infection going on.
胎盤知道有感染正在發生。
the more severe the infection is, the more change is happening in the baby's immune response
感染越嚴重，嬰兒免疫反應發生的變化就越大。
Brianna29:26
our data suggests that immunologic rather than virologic signals are responsible for profound changes in the fetal immune landscape
我們的數據表明，造成胎兒免疫格局劇變的是免疫學信號，而不是病毒學信號。
Expression and DNA methylation profiling revealed no detectable unintended targets in the human genome and Creme 1001 induced transient liver transaminase elevations only at the very highest dose tested.
基因表達和DNA甲基化分析顯示，人類基因組中未檢測到意外靶點；Creme 1001只在最高劑量下引起一過性肝轉氨酶升高。
Kathy45:40
Hepatitis B, 250 million people infected, a million deaths a year, and nobody talks about it.
乙肝，2.5億人感染，每年百萬人死亡，卻沒人談論它。
So this is a totally cooked up protein, right? Totally cooked up.
所以這完全是個人造出來的蛋白質，對吧？徹頭徹尾人造的。
Rich51:43
This is going away very very quickly.
它消失得非常非常快。
數字與實體
| 全球乙肝感染人數 | 2.5億人 | 46:40 |
| 初篩guide RNA總數 | 121條 | 39:37 |
| 抗原下降超50%的guide RNA數量 | 51條 | 57:50 |
| 轉基因小鼠表面抗原最大降幅 | 2.7個log | 1:03:53 |
| 轉基因小鼠病毒DNA最大降幅 | 2.9個log | 1:03:53 |
| 最高劑量組核心抗原轉陰肝細胞比例 | 98% | 1:04:53 |
| guide RNA疑似脫靶位點數 | 1591個(確認異常甲基化4處，0個驗證脫靶) | 1:16:04 |
| 感染孕猴中死胎比例 | 2/11(該機構歷史背景死胎率2.6%) | 16:19 |
| 美國孕婦季節性流感疫苗接種率 | 約一半 | 33:29 |
術語
- cccDNA共價閉合環狀DNA
- 乙肝病毒在細胞核內游離存在的DNA形式，是持續產生新病毒和抗原的源頭
- dCas9催化失活的Cas9
- 經改造後只能結合DNA、不能切割DNA的Cas9蛋白
- epigenetic silencing表觀遺傳沉默
- 通過DNA甲基化等修飾關閉基因轉錄，而不改變DNA序列本身
- nukes (nucleos(t)ide analogs)核苷(酸)類似物
- 乙肝現有一線抗病毒藥，能抑制複製但清不掉病毒DNA和抗原
- VUT (verified unintended target)已驗證的意外靶點
- 既出現異常甲基化、又伴隨基因表達改變的脫靶位點
- guide RNA導向RNA
- 引導Cas9類蛋白精準結合到目標DNA序列的短RNA分子
收聽指南
關注乙肝/基因治療的醫藥研發者、投資人，以及對孕期病毒感染免疫機制感興趣的臨床和公共衛生從業者。
83分鐘後的聽眾郵件和本期個人推薦環節與兩篇論文關係不大，可跳過。