不剪一刀DNA,新疗法让98%乙肝肝细胞停止产生病毒蛋白
现有乙肝药只能压制病毒复制、清不掉占据细胞核的病毒DNA;新疗法用改造过的dCas9给病毒DNA打上永久甲基化标签，让它在肝细胞里彻底沉默。
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死胎率是背景值数倍
11只孕晚期豚尾猴被经鼻、气管、眼、口同时接种高剂量甲流病毒以确保感染，但仍有4只全程没有症状，另有2只病情最重，其中一只(编号Blue Nine)发生死胎。这家机构6年数据显示正常妊娠死胎率是2.6%,这次11只里出了2只死胎(孕134天和121天，约为足月172天的七成多)。母猴体内病毒自始至终局限在肺部，血浆检测不到病毒RNA。
— Kathy病毒没过胎盘，胎盘自己报警
只有2例在胎盘绒毛组织里检出低拷贝病毒RNA,胎儿的脑、脊髓、心、肝、脾等组织全部阴性——没有垂直传播，胎盘挡住了病毒。但胎盘绒毛组织里IL-1β、IL-18、干扰素β等细胞因子明显升高，185个基因上调、178个下调，说明胎盘自己启动了抗病毒反应。没人知道是什么信号穿过了胎盘让它做出反应，研究者也坦言这是留给下一步研究的问题。
母亲越重，胎儿免疫越乱
母猴肺部病情越重、1型干扰素水平越高，胎儿血液和肺里的CD8 T细胞、树突状细胞等免疫群体变化就越大，即便病毒从未进入胎儿体内。研究者特别强调，这个结果不该被读成「孕期免疫反应本身很危险」,反而说明打疫苗、避免孕妇发展成重症，才是减少胎儿免疫紊乱最直接的办法。
— Brianna乙肝药压病毒，压不掉DNA
全球2.5亿人感染乙肝，每年约百万人死于肝硬化和肝癌，却几乎没有媒体关注——只有反疫苗声音出现时才会被提起。现有一线药物「nukes」能抑制病毒复制、降低硬化和癌变风险，但清不掉细胞核里的共价闭合环状DNA(cccDNA)和整合进宿主基因组的病毒DNA,也压不住表面抗原的产生，患者往往要像HIV感染者一样终身服药。
不剪DNA,给病毒打沉默标签
新疗法Crema 1001的核心是一个完全人造的融合蛋白：催化失活的Cas9(只结合DNA不切割)+抑制转录的KRAB结构域+甲基化效应结构域，由guide RNA引导精准停靠到乙肝基因组上。研究者从121条候选guide RNA里筛出51条能让抗原下降超过50%,最终选定对各基因型兼容性最好的gRNA2。整套机制借用CRISPR的定位能力，却完全不使用它的切割功能。
— Kathy单次注射，98%肝细胞转阴
在整合了两套乙肝全基因组的转基因小鼠模型里，单次给药让表面抗原最多下降2.7个log、病毒DNA下降2.9个log,效果维持满7个月观察期；15只小鼠里11只抗原降到检测限以下，最高剂量组98%的肝细胞核心抗原染色呈阴性——但整合的病毒DNA仍然原样留在细胞里，只是被永久沉默，没有被切除。
— Kathy药7天排空，沉默却留下了
注射的guide RNA、效应蛋白mRNA在24小时内达到峰值，但7天后体内已经检测不到任何残留；而病毒DNA上的甲基化标记在给药后第3天达到顶峰，并一直持续到实验观察期结束。此前同类研究显示这种甲基化标记能在小鼠和非人灵长类体内维持超过一年——药物本身很快被清除，但留下的沉默开关会随细胞分裂一起传下去。
— Rich1591个疑点，只剩4个
用最多允许4个错配的条件做计算机预测，在肝细胞、脾内皮细胞、肾上腺皮质细胞里一共找到1591个guide RNA可能误伤的位置；逐一验证后，只有4处真的出现异常甲基化，而且全部没有对应的基因表达改变，因此研究者认定没有「已验证的意外靶点」。作者也承认每种细胞只测了一个供体、没检测生殖细胞，监管层面还会有更多要求。
— Kathy原话 · 已逐字校验
The placenta knows there's an infection going on.
胎盘知道有感染正在发生。
the more severe the infection is, the more change is happening in the baby's immune response
感染越严重，婴儿免疫反应发生的变化就越大。
Brianna29:26
our data suggests that immunologic rather than virologic signals are responsible for profound changes in the fetal immune landscape
我们的数据表明，造成胎儿免疫格局剧变的是免疫学信号，而不是病毒学信号。
Expression and DNA methylation profiling revealed no detectable unintended targets in the human genome and Creme 1001 induced transient liver transaminase elevations only at the very highest dose tested.
基因表达和DNA甲基化分析显示，人类基因组中未检测到意外靶点；Creme 1001只在最高剂量下引起一过性肝转氨酶升高。
Kathy45:40
Hepatitis B, 250 million people infected, a million deaths a year, and nobody talks about it.
乙肝，2.5亿人感染，每年百万人死亡，却没人谈论它。
So this is a totally cooked up protein, right? Totally cooked up.
所以这完全是个人造出来的蛋白质，对吧？彻头彻尾人造的。
Rich51:43
This is going away very very quickly.
它消失得非常非常快。
数字与实体
| 全球乙肝感染人数 | 2.5亿人 | 46:40 |
| 初筛guide RNA总数 | 121条 | 39:37 |
| 抗原下降超50%的guide RNA数量 | 51条 | 57:50 |
| 转基因小鼠表面抗原最大降幅 | 2.7个log | 1:03:53 |
| 转基因小鼠病毒DNA最大降幅 | 2.9个log | 1:03:53 |
| 最高剂量组核心抗原转阴肝细胞比例 | 98% | 1:04:53 |
| guide RNA疑似脱靶位点数 | 1591个(确认异常甲基化4处，0个验证脱靶) | 1:16:04 |
| 感染孕猴中死胎比例 | 2/11(该机构历史背景死胎率2.6%) | 16:19 |
| 美国孕妇季节性流感疫苗接种率 | 约一半 | 33:29 |
术语
- cccDNA共价闭合环状DNA
- 乙肝病毒在细胞核内游离存在的DNA形式，是持续产生新病毒和抗原的源头
- dCas9催化失活的Cas9
- 经改造后只能结合DNA、不能切割DNA的Cas9蛋白
- epigenetic silencing表观遗传沉默
- 通过DNA甲基化等修饰关闭基因转录，而不改变DNA序列本身
- nukes (nucleos(t)ide analogs)核苷(酸)类似物
- 乙肝现有一线抗病毒药，能抑制复制但清不掉病毒DNA和抗原
- VUT (verified unintended target)已验证的意外靶点
- 既出现异常甲基化、又伴随基因表达改变的脱靶位点
- guide RNA导向RNA
- 引导Cas9类蛋白精准结合到目标DNA序列的短RNA分子
收听指南
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83分钟后的听众邮件和本期个人推荐环节与两篇论文关系不大，可跳过。